Uutiset - Liuenneen hapen pitoisuuksien seuranta biofarmaseuttisessa fermentaatioprosessissa

Mikä on liuennut happi?

Liuennut happi (DO) viittaa molekyylihappeen (O_₂), joka on liuennut veteen. Se eroaa vesimolekyyleissä olevista happiatomeista (H_₂O), koska se esiintyy vedessä itsenäisinä happimolekyyleinä, jotka ovat peräisin joko ilmakehästä tai vesikasvien fotosynteesin kautta syntyneitä. Liuotinhajoavan hapen pitoisuuteen vaikuttavat useat tekijät, kuten lämpötila, suolapitoisuus, veden virtaus ja biologiset aktiivisuudet. Sellaisenaan se toimii kriittisenä indikaattorina vesiympäristöjen terveyden ja saastumistilan arvioinnissa.

Liuenneella hapella on tärkeä rooli mikrobien aineenvaihdunnan edistämisessä, vaikuttaen soluhengitykseen, kasvuun ja aineenvaihduntatuotteiden biosynteesiin. Korkeammat liuenneen hapen pitoisuudet eivät kuitenkaan ole aina hyödyllisiä. Liiallinen happi voi johtaa kertyneiden tuotteiden metabolian lisääntymiseen ja mahdollisesti aiheuttaa myrkyllisiä reaktioita. Optimaaliset liuenneen hapen tasot vaihtelevat eri bakteerilajien välillä. Esimerkiksi penisilliinin biosynteesin aikana liuenneen hapen määrä pysyy tyypillisesti noin 30 %:n ilman kyllästymisasteessa. Jos liuenneen hapen määrä laskee nollaan ja pysyy tällä tasolla viisi minuuttia, tuotteen muodostuminen voi heikentyä merkittävästi. Jos tämä tila jatkuu 20 minuuttia, voi syntyä peruuttamattomia vaurioita.

Tällä hetkellä yleisimmin käytetyt DO-anturit pystyvät mittaamaan vain suhteellisen ilman kylläisyyden, eivätkä liuenneen hapen absoluuttista pitoisuutta. Viljelyalustan steriloinnin jälkeen ilmastetaan ja sekoitetaan, kunnes anturin lukema vakiintuu, jolloin arvo asetetaan 100 %:n ilman kylläisyyteen. Myöhemmät mittaukset käymisprosessin aikana perustuvat tähän referenssiin. Absoluuttisia DO-arvoja ei voida määrittää standardiantureilla, ja ne vaativat kehittyneempiä tekniikoita, kuten polarografiaa. Ilman kylläisyyden mittaukset ovat kuitenkin yleensä riittäviä käymisprosessien seurantaan ja hallintaan.

Fermentorin sisällä DO-tasot voivat vaihdella eri alueilla. Vaikka lukema olisi jossain vaiheessa vakaa, vaihteluita voi silti esiintyä tietyissä viljelyalustoissa. Suuremmissa fermentoreissa DO-tasoissa on taipumus esiintyä suurempia paikallisia vaihteluita, mikä voi vaikuttaa merkittävästi mikrobien kasvuun ja tuottavuuteen. Kokeelliset todisteet ovat osoittaneet, että vaikka keskimääräinen DO-taso voi olla 30 %, fermentaation suorituskyky vaihtelevissa olosuhteissa on huomattavasti alhaisempi kuin vakaissa olosuhteissa. Siksi fermentorien skaalauksessa – geometrisen ja tehon samankaltaisuuden lisäksi – DO-tasojen paikallisten vaihteluiden minimointi on edelleen keskeinen tutkimustavoite.

Miksi liuenneen hapen seuranta on olennaista biofarmaseuttisessa fermentaatiossa?

1. Ylläpitääkseen mikro-organismien tai solujen optimaalista kasvuympäristöä
Teollisessa käymisessä käytetään tyypillisesti aerobisia mikro-organismeja, kuten Escherichia coli ja hiiva, tai nisäkässoluja, kuten kiinanhamsterin munasarjasoluja (CHO). Nämä solut toimivat "työntekijöinä" käymisjärjestelmässä ja tarvitsevat happea hengitykseen ja aineenvaihduntaan. Happi toimii aerobisen hengityksen terminaalielektroniakseptorina, mikä mahdollistaa energian tuotannon ATP:n muodossa. Riittämätön hapen saanti voi johtaa solujen tukehtumiseen, kasvun pysähtymiseen tai jopa solukuolemaan, mikä lopulta johtaa käymisen epäonnistumiseen. DO-tasojen seuranta varmistaa, että happipitoisuudet pysyvät optimaalisella alueella solujen jatkuvan kasvun ja elinkelpoisuuden kannalta.

2. Kohdetuotteiden tehokkaan synteesin varmistamiseksi
Biofarmaseuttisen fermentaation tavoitteena ei ole pelkästään edistää solujen lisääntymistä, vaan myös helpottaa haluttujen kohdetuotteiden, kuten insuliinin, monoklonaalisten vasta-aineiden, rokotteiden ja entsyymien, tehokasta synteesiä. Nämä biosynteesireitit vaativat usein huomattavaa energiankulutusta, joka on pääasiassa peräisin aerobisesta hengityksestä. Lisäksi monet tuotesynteesiin osallistuvat entsymaattiset järjestelmät ovat suoraan riippuvaisia hapesta. Hapenpuute voi häiritä tai vähentää näiden reittien tehokkuutta.

Lisäksi liuenneen hapen määrä toimii säätelysignaalina. Sekä liian korkeat että liian matalat liuenneen hapen pitoisuudet voivat:
- Muuttaa solujen aineenvaihduntareittejä, esimerkiksi siirtymällä aerobisesta hengityksestä vähemmän tehokkaaseen anaerobiseen käymiseen.
- Laukaisevat solujen stressireaktioita, mikä johtaa ei-toivottujen sivutuotteiden tuotantoon.
- Vaikuttaa eksogeenisten proteiinien ilmentymistasoihin.

Kontrolloimalla tarkasti DO-tasoja fermentaation eri vaiheissa on mahdollista ohjata solujen aineenvaihduntaa kohti maksimaalista kohdetuotesynteesiä, jolloin saavutetaan korkea tiheys ja korkea saanto fermentaatiossa.

Johdatus biolääkkeiden vesivirtauskaavioon

3. Hapenpuutteen tai liiallisuuden estämiseksi
Hapenpuute (hypoksia) voi aiheuttaa vakavia seurauksia:
- Solujen kasvu ja tuotteiden synteesi lakkaavat.
- Aineenvaihdunta siirtyy anaerobisiin reitteihin, mikä johtaa orgaanisten happojen, kuten maitohapon ja etikkahapon, kertymiseen, jotka alentavat viljelyalustan pH:ta ja voivat myrkyttää soluja.
- Pitkittynyt hypoksia voi aiheuttaa peruuttamattomia vaurioita, eikä toipuminen ole täydellistä edes hapen saannin palautumisen jälkeen.

Liiallinen happi (ylikylläisyys) aiheuttaa myös riskejä:
- Se voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja reaktiivisten happilajien (ROS) muodostumista, jotka vahingoittavat solukalvoja ja biomolekyylejä.
- Liiallinen ilmastus ja sekoitus lisäävät energiankulutusta ja käyttökustannuksia, mikä johtaa tarpeettomaan resurssien tuhlaamiseen.

4. Kriittisenä parametrina reaaliaikaisessa seurannassa ja takaisinkytkennän hallinnassa

DO on reaaliaikainen, jatkuva ja kattava parametri, joka heijastaa käymisjärjestelmän sisäisiä olosuhteita. DO-tasojen muutokset voivat herkästi osoittaa erilaisia fysiologisia ja toiminnallisia tiloja:
- Nopea solukasvu lisää hapenkulutusta, mikä aiheuttaa liuenneen hapen tason laskua.
- Substraatin väheneminen tai estyminen hidastaa aineenvaihduntaa, mikä vähentää hapenkulutusta ja nostaa liuenneen hapen määrää.
- Vierasmikrobien aiheuttama kontaminaatio muuttaa hapenkulutusmallia, mikä johtaa epänormaaleihin liuenneen hapen vaihteluihin ja toimii varhaisena varoitusmerkkinä.
- Laitteiden toimintahäiriöt, kuten sekoittimen vikaantuminen, tuuletusputken tukkeutuminen tai suodattimen likaantuminen, voivat myös johtaa DO-käyttäytymisen poikkeavuuteen.

Integroimalla reaaliaikainen DO-seuranta automaattiseen takaisinkytkentäjärjestelmään, DO-tasojen tarkka säätö voidaan saavuttaa seuraavien parametrien dynaamisilla muutoksilla:
- Sekoitusnopeus: Nopeuden lisääminen parantaa kaasun ja nesteen välistä kosketusta hajottamalla kuplia ja siten parantamalla hapensiirtotehokkuutta. Tämä on yleisimmin käytetty ja tehokkain menetelmä.
- Ilmastusnopeus: Sisään tulevan kaasun virtausnopeuden tai koostumuksen säätäminen (esim. ilman tai puhtaan hapen osuuden lisääminen).
- Säiliöpaine: Paineen nostaminen lisää hapen osapainetta, mikä parantaa liukoisuutta.
- Lämpötila: Lämpötilan alentaminen lisää hapen liukoisuutta viljelyalustassa.

BOQUn tuotesuositukset biologisen käymisen online-seurantaan: